Александр Малый
Доктор остеопат
и врач народной медицины
   
 
Доктор Александр Малый Задать вопрос доктору

Оценка эффективности применения экстракта жука педеруса и гамма облучения на клетки HeLa (полученные из опухоли шейки матки)

Клиническое  исследование  иранских  медиков: Fariba Samani 1, Ali Shabestani Monfared 1*, Ebrahim Zabihi 1, 2, Soraya Khafri 3, Maesoumeh Karimi 4, Haleh Akhavan Niaki 1

Краткое описание

 Цель: Рак шейки матки  является  злокачественной  опухолью, которая  занимает  второе место по распространенности  причины  смерти  у женщин во всем  мире . Экстракт, полученный  от жука  педеруса ( Стафилинид-синекрыл)  (PBE), содержит в себе  биологически активные компоненты  такие, как  педерин, обладающий  цитотоксичными  свойствами и блокирующий ДНК и белковый синтез при очень  низких концентрациях. В данном  исследовании мы попытались  определить  эффективность комбинированного  лечения  с применением  экстракта  жука педеруса ( PBE) и гамма  облучения  на клетках HeLa.

Материалы  и  Методы: Жизнеспособность  клеток  определялась  двумя  методами: посредством  применения MTT- теста и анализа  колониеобразования.

Результаты: Мы обнаружили, что сочетание  терапии гамма облучением  и применения  экстракта  жука  педеруса (PBE)  не приводит  к повышению гибели клеток, кроме того, экстракт педеруса может  даже препятствовать  цитотоксичности при концентрации  ниже 0.1 нг/мл, при этом  жизнеспособность  клеток  при облучении  в сравнении  с облучением  в сочетание  с применением экстракта  жука педеруса ( PBE)  составила  37%: 60%.

Вывод: Такой результат  может быть следствием радиозащитного эффекта  очень низких  доз  экстракта  жука педеруса ( PBE) в сравнение с гамма облучения.

Введение

Рак шейки матки  является  злокачественной  опухолью, которая  занимает  второе место по распространенности  причины  смерти  у женщин во всем  мире, при этом, для борьбы с этим заболеванием  используются различные  виды  лечения (1). Согласно данным  Международной Федерации  Гинекологии  и Акушерства (МФГА), рак шейки матки представляет  собой неоплазию , которая включает в себя 4  стадии: стадии I и II, которые характеризуются  местным распространением, а также  стадии  III и IV, которые  характеризуются  метастазированием.

(2). Как  правило, лечение  рака  шейки матки проводится  хирургическим путем, проведением  лучевой  терапии или химиолучевой  терапии (3).

Для местно распространенного типа  заболевания согласно  системе Международной Федерации  Гинекологии  и Акушерства (МФГА),  лучевая  терапия является  первостепенным методом  лечения.  При  проведении  лучевой  терапии здоровая  ткань,  связанная  с опухолью, повреждается, по этой причине  общая  доза такого  лечения ракового  заболевания, лимитируется. Следовательно,  применение  любой  комбинации, которая  позволяет увеличить  терапевтическую  эффективность облучения  без изменения дозировки считалось  бы  чрезвычайно  полезным  в данном случае  (4).

Самыми распространенными  препаратом, которые можно использовать в качестве радиосенсибилизирующего  вещества при проведении  лечения  рака шейки матки является  цисплатин, который может быть также  использован в качестве  сенсибилизирующего  вещества для  гипоксических клеток (5). Карбоплатин, недаплатин, камптотецин, паклитаксел, гемцитабин  также представляют  собой радиосенсибилизирующие  вещества, которые  использовались  в клинических  и не клинических  испытаниях (6).  В течение  последних  нескольких лет разрабатывались лекарственные  препараты  природного  происхождения  для использования в качестве  противоопухолевых  препаратов. Они использовались, как  в формах природного  происхождения, так и синтетических. Антибиотики,  полученные из микробов, такие как, например, блеомицин , актиномицин, митомицин C, или  компоненты, полученные из  растений, такие, как бисиндольные  алкалоиды, эпиподофиллотоксины , таксаны.  Эти компоненты  являются  лишь  некоторыми  примерами  длинного списка  противоопухолевых  компонентов  природного происхождения (7).

Гемалимфа  жуков  педерус  (Стафилиниды–синекрылы ) содержит в своем  составе биологически активные компоненты которые могут  вызвать определенный  тип повреждения кожи, который  известен под  названием  линейный дерматит (8) . Самым  важным  химическим  компонентом, находящимся в гемалимфе  этого жука, является  педерин.  Другие  химические  компоненты, такие как: кантаридин , педерон  и псевдопедерин  and pseudopederin оказывается  играют  весьма незначительную  роль  в цитотоксическом  эффекте экстракта, полученного из жука педериуса  (PBE) (8). Педерин  является  симбиотическим  компонентом, который  вырабатывается  определенным видом  бактерии, которая имеет тесную  взаимосвязь с синегнойной  палочкой    (Pseudomonas aeruginosa) (9).

Данный компонент  имеет  небелковую  структуру (10)  и  обладает  цитотоксическими  свойствами, которые   способны  убивать  раковые  клетки  у растений,  крыс  и   мышей  (8). Согласно  исследованиям  макромолекулярного  синтеза  с использованием радиоактивных предшественников, педерин вступает  в конфликт с белком, препятствует синтезу  ДНК и  в конечном счете  блокирует  их выработку, но при этом не влияет на РНК синтез  (11). Данный компонент  также  стимулирует  слияние  клеток в фибробласте  кожи человека , в лабораторных  условиях (12) .

Педерин, как основной  цитотоксический  компонент экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  обладает сильными  побочными эффектами  при систематическом  использовании  на человеке, и несмотря на то что  проведенные  многочисленные исследования, указывающие  на его  противоопухолевое  действие, никаких  исследований  не было проведено  относительно эффекта  комбинирования экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) с ионизирующим  облучением на линии  раковых  клеток. Следовательно, данное  исследование  было направлено  на то, чтобы  оценить потенциальный эффект воздействия  комбинирования  экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) с ионизирующим  облучением на клетки HeLa.

 Материалы и Методы

Клетки  и реагенты

Линия клеток HeLa  была получена из  Иранского  Исследовательского  Института  Пастера.  Среда для культур клеток и тканей RPMI1640  (традиционно используется для выращивания лимфоидных клеток человека), фетальная бычья  сыворотка   (FBS) и  PenStrep® (пенициллин 10000 IU +стрептомицин 10 мг/мл)  были  приобретены в  PAA Лаборатории GmbH (Австрия). Краситель Гимза (0.4%) и  MTT анализ (3-(4, 5- диметилтиазол — тиазол-2-ил)-2, 5 дифенилтетразолия бромида ) были  приобретены  в компании  «Sigma Aldrich Co». (UK). MTT порошок   был растворен  в  фосфатно-солевом буфере  (ФСБ) в концентрации  5 мг/мл. Изопропиловый  спирт  (2-пропанол), метанол и дымящаяся  соляная хлористоводородная  кислота  (37%) были  приобретены  в компании  «Merck Chemicals» (Германия).

Облучение

Клетки были подвергнуты гамма облучению  60Co из источника «Theratone780»  (ACL, Канада)  с  мощностью  дозы  облучения 1.01 Грэй/мин. Расстояние источник — поверхность — 80 см. Как  правило, дозы облучения  излучались  в двух  формах: (0.5, 1, 1.5  2 Гр) w с размером  поля облучения 9×13 для проведения анализа  колониеобразования  и (1, 2 и 4 Гр) с размером  поля облучения  9×5   для проведения  MTT-теста (13).

Приготовление  экстракта  из жука педеруса

Приблизительно 1×103 взрослых насекомых (Педерус  стафилиниды — синекрылы) были собраны, измельчены  и смешаны  с этиловым спиртом  (99%). Смесь поместили в встряхиватель-инкубатор    (37°C) на 2 часа. Затем, гемогенат был подвергнут центрифугированию, а после  декантирования  надосадочную жидкость  поместили  в чашку Петри  и оставили  просыхать на ночь. Высушенный экстракт растворили  в этиловом спирте (99%)  и разбавили средой для культур клеток и тканей RPMI1640  для приготовления  различных концентраций

Пролиферационные  тесты

Определение жизнеспособности  посредством использования  MTT-теста

Клетки  посеяли  в 96ти-луночных  плашках (7×103 клетки/плашка), а затем  провели  MTT-тест   спустя 24 часа, 48 часов, 72 часа и 96  часов после  обработки с применением различных  концентраций экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  (1.7, 34, 3.4×102 и 3.4×103 нг/мл)  в полной  среде (RPMI-1640 обогащенной  (10% фетальной бычьей  сывороткой   (FBS)  и 1% PenStrep®), различными  дозами гамма облучения (1, 2 и 4 Гр)  а также комбинацией  и того и другого. Для исследования  комбинированного  эффекта экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  и облучения, клетки  подвергались  обработке  вышеупомянутыми  концентрациями экстракта  на протяжение 22 часов. Затем, клетки подвергались облучению в дозировке 2 Гр. И наконец, для проведения  MTT-теста , 15 т/л MTT раствора (5 мг/мл) добавили  в каждую  плашку, а затем плашки выдерживались  при температуре  37°C  на протяжение 3.5  часов. Осажденный  формазан растворили  в 200 т/л кислотного изопропанола, при этом оптическая плотность  измерялась  посредством  использования  автоматического  фотометра для микропланшет  («Ryto RT-2100», Китай)  при длине  волны  570 нм.

Определение жизнеспособности  посредством использования  анализа  колониеобразующей активности.

Клетки HeLa культивировались, как трипликатные   в  6 -ти  луночных  плашках  с плотностью 900 или 1200 клеток/плашка  с питательной  средой для культивирования  4.5 мл. Эффективность  посева  данным методом  составила  приблизительно  20%. После 24 часов инкубации, клетки были   подвергнуты  обработке различными концентрациями экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  (34×10-3, 34×10-2 , 34, 3.4×102 и 3.4×103 нг/мл), различными  дозами  облучения (0.5, 1, 1.5 и 2 Гр) или  комбинацией  обоих  типов обработки  на протяжении  2 часов. Для  того, чтобы  исследовать комбинированный  эффект воздействия экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и облучения, клетки  подвергались  обработке вышеупомянутыми концентрациями  экстракта  на протяжении  22 часов, а затем клетки были  подвержены  облучению  в  дозировке  2 Гр. Питательная среда для культивирования изменялась, а  клетки  подвергались инкубированию на протяжение  следующих  10 дней. На  12–й день (после посева клеток), питательную среду для культивирования  удаляли, а клетки окрашивались  красителем  Гимза  (0.4%), а колонии  с ≥ 50 клетками  считались колониями  выживания. Анализ  данных проводился  посредством применения   дисперсионного  анализа  «ANOVA»  и  множественных сравнений.

Результаты

MTT –тест

Пролиферация  клеток  (за исключением  самой  низкой  концентрации ) репрессировалась   в зависимости от дозы  путем увеличения  времени  воздействия экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и  цитотоксичности свыше 48 часов, достигая  максимального эффекта  (0.001 < P-величина  ≤ 0.05) .Жизнеспособность  клеток  не снизилась в значительной степени  после облучения, за исключением  использования  дозы 4 Гр на протяжение  96 часов (0.001 < P-величина  ≤ 0.05). Так как доза  2 Гр   в повседневной  практике  используется в лучевой терапии, было принято решение для облучения  использовать  дозу 2 Гр с в комбинации  с различными   концентрациями  экстракта. Пролиферация  клеток  репрессировалась дозозависимым способом. MTT–тест показал, что жизнеспособность клеток обработанных  комбинированным  способом: облучением  и  применением экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) была значительно ниже, в сравнении  с теми клетками, которые  были обработаны только  инфракрасным  облучением  после 48 часов, но не настолько  значительно  низкой, как  в клетках, обработанных  только экстрактом, полученным из жука педеруса  (PBE).

Анализ колониеобразующей  активности

Коэффициенты выживания клеток HeLa снижался  при увеличении  доз гамма облучения, при этом    гамма облучение  при дозах, превышающих 1 Гр вызывало  значительное уменьшение  коэффициента  выживания по сравнению  с контрольной  группой, как показано на Рис.1 Коэффициенты выживания  клеток HeLa  снижались  при увеличении  концентраций экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE), при этом за исключением  самой низкой концентрации  экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE), жизнеспособность  была значительно ниже, чем в контрольной  группе (Рис 2). Кривая  выживания  клеток HeLa, обработанных  комбинацией  различных  концентраций экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и облучением с дозировкой 2Гр не  продемонстрировала  значительной  разницы  при сравнении с кривой выживания при использовании  экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE). Какк правило коэффициенты  выживания  при использовании  комбинации экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и облучения в сравнении  с использованием  только экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) были  не слишком низкими. Также  при сравнении  обработки клеток  только облучением, после  обработки  комбинацией  самыми  низкими  концентрациями экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и облучения, можно отметить, что клеток выжило  больше (Рис 2).

 Рис  1. Кривая выживания клеток  HeLa, подверженных  гамма облучению

Рис 2. Кривая выживания  клеток HeLa , подверженных  воздействию  экстракта, полученного  из жука  педерус   (- — -), а также в комбинации использования   экстракта, полученного  из жука педериус  и гамма  облучения (_)

Обсуждение

Лучевая  терапия  является самым  распространенным  методом лечения рака шейки матки, но  комбинирование  препаратов, обладающих радиосенсибилизирующим эффектом  и облучения всегда играет очень важную роль при  лечении  данной злокачественной  опухоли. Такая стратегия  позволяет снизить тотальные дозы облучения, таким образом можно уменьшить  побочные эффекты  лучевой  терапии  и в тоже  время увеличить эффективность лечения  (4).

В данном исследовании изучался  эффект комбинированного воздействия экстракта, полученного из жука педеруса (PBE) и гамма облучения на клетки HeLa.  Согласно, полученным нами результатам, экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE) не продемонстрировал  какого-либо статистически  значительного радиосенсибилизирующего  свойства. При проведении данного исследования  применялся  MTT-тест с целью обнаружения  острых эффектов, а также проводился анализ колониеобразования с целью исследования замедленного действия  препарата и ионизирующего излучения  на клетки  HeLa.

Результаты, полученные после проведения MTT-теста показали, что экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE)  обладает цитотоксическим эффектом при низких концентрациях (приблизительно 30 нг/мл). Подобные  результаты  были  опубликованы  относительно   цитотоксичности педерина  на линии  клеток HeLa, посредством  использования  различных тестовых процедур (14). Основываясь  на полученных нами  результатах , можно сказать, что  гамма облучение  не приводит к статистически значительному уменьшению клеточной пролиферации при дозах, которые  обычно используются  при проведении обычной  лучевой терапии (2 Гр)  по крайней мере  на протяжение  96 часов после оказания  воздействия. Анализ колониеобразования  является целесообразным  методом  для проведения  радиобиологических исследований,  что позволяет оценить  эффект воздействия  ионизирующего облучения  на клетки, с использованием препаратов, или без (15). Результаты, полученные после проведения анализа колониеобразования показали, что  гамма облучение в дозах выше 1 Гр обладает антипролиферативным действием на линию  клеток  on HeLa. Также, основываясь на данных, полученных в результате этого метода,  можно сказать, что экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE) является сильным ингибитором клеточной  пролиферации, что может привести к тотальной гибели  клеточной  популяции при концентрациях  ниже 1 мкг/мл.

Педерин является природным  компонентом, экстракта, полученного из жуков стафилинидов     (coleopter P. Fuscipes) (11). Это биологически активный компонент, вызывающий слияние фибробластов (12), он обладает  антибактериальными свойствами и подавляет  рост клеточных линий  млекопитающих  при низких концентрациях  (8, 10). Так как механизм  цитотоксичности  экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  пока еще  остается  непонятным, мы продемонстрировали, что экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE) при низких концентрациях  может  ингибировать  клеточную  пролиферацию. Данное открытие  демонстрирует  потенциал педерина (цитотоксического  компонента экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)), как продукта  природного происхождения для лечения  раковых клеточных линий.  Комбинированное использование экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) и гамма облучения  против клеток HeLa, как  проиллюстрировано выше не имело  дополнительного или совместного  влияния, если сравнивать  с каждым  фактором в отдельности. Кроме того, наблюдалось увеличение жизнеспособности клеток  при использовании экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE) (при  концентрациях  ниже  0.1 нг/мл)  при этом использовалось  гамма облучение. Похоже, что при очень низких концентрациях экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE), количество  педерина снижается  и не только  вызывает меньшую  цитотоксичность, но также может  защитить клетки  от эффектов ионизирующего  облучения.

Похоже, что экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE) уменьшает   антипролиферативное  действие облучения, а следовательно может спасти клетки  от повреждения, вызванного  ионизирующим  облучением на биологических системах. Тем не менее,  такое  заявление  требует  проведения большего количества  исследований механизма  действия других компонентов, присутствующих  в экстракте, полученном из жука педеруса  (PBE), чтобы подтвердить  его   радиационно-защитные свойства .

Заключение

Согласно  полученным  нами  результатом  комбинированное  использование экстракта, полученного из жука педеруса  (PBE)  и гамма  облучения не привело к  радиосенсибилизации.  Кроме того, полученные  результаты  продемонстрировали, что экстракт, полученный из жука педеруса  (PBE) при  очень низких концентрациях  может  быть химическим средством радиационной защиты, однако данное открытие  требует  дальнейших исследований.

Перевод с  английского:

Источникhttp://ijbms.mums.ac.ir/volume_391.html

 


Создание сайта: студия Сергея Каминского © 2012 —2021 amaliy.com все права защищены