Александр Малый
Доктор остеопат
и врач народной медицины
   
 
Доктор Александр Малый Задать вопрос доктору

Новый Антимикробный Пептид, Полученный из Педерус-дерматита.

Mina Memarpoor-Yazdi • Hadi Zare-Zardini •Ahmad Asoodeh

Аннотация  Большая  часть исследований  сфокусирована  на антимикробных пептидах, полученных из  реакций  иммунной защиты насекомых благодаря их потенциалу   в разработке новых  антибиотиков.  В данном  исследовании,  новый антимикробный  пептид, полученный  из насекомого Педерус- дерматита, получил название «Саркотоксин  Пд» (sarcotoxin Pd), данный пептид  был  выявлен  и подвержен  очищению посредством использования  гель фильтрации и обращено-фазной хроматографии. Полученные  нами результаты  показали,  что данный  пептид обладает широким спектром ингибирующих  эффектов на исследуемых микробах. «Саркотоксин Пд» ( Sarcotoxin Pd)  состоит  из 34 аминокислот , а их  молекулярный  вес  был определен, как   3613.26 ± 0.5 Да. Минимальные значения ингибиторной  концентрации  «Саркотоксина Пд»  (sarcotoxin Pd) в сравнении с Грам-негативной бактерией  были  ниже, чем у Грам-негативной  бактерии и грибков. Данный  выявленный пептид продемонстрировал  высочайший  антимикробный эффект против  клебсиелла пневмонии и кишечной палочки. Данный пептид не продемонстрировал  значительной гемолитической  активности  против красных кровяных телец  человека, в частности  в диапазоне значений  минимальной  ингибиторной  концентрации. Подтверждая  потенциал  антимикробной активности синтетического пептида, данная  научная работа посвящается  роли   «Саркотоксина Д» в лечении системных микробных  заболеваний.

Ключевые слова  Педерус-дерматит, гель  фильтрация  антимикробных пептидов, обращенно-фазовая высоко эффективная жидкостная хроматография,  минимальная  ингибиторная  концентрация,  реакция гемолиза.

___________________________________________________________________________________

  1. Memarpoor-Yazdi
    Department of Biology, Faculty of Sciences, Mashhad Branch,
    Islamic Azad University, Mashhad, Iran
    e-mail: mmemarpooryazdi@yahoo.com
    H. Zare-Zardini (&)
    Young Researchers Club, Yazd Branch, Islamic Azad
    University, Yazd, Iran
    e-mail: ha_za63@yahoo.com
    A. Asoodeh
    Cellular and Molecular Research Group, Institute of
    Biotechnology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran

Введение

На сегодняшний день, широко распространенное употребление, как внутри медицины, так и за ее пределами, играет важную роль  в появлении бактериальных штаммов, устойчивых к антибиотикам.(Hancock and Sahl 2006; Toke 2005). Следовательно, разработка  новых  антимикробных компонентов  является чрезвычайно активной областью  в биологических исследованиях. Признано, что антимикробные пептиды  являются  подходящей альтернативой классическим  антибиотикам (Boman 1995; Montan˜o et al. 2011; Zasloff 2002). Эти пептиды были выделены  из различных источников, таких как растения  (Manners 2009), беспозвоночные  животные (Hwang et al. 2009; Kang et al. 2011), позвоночные (Boman 2003; Wang et al. 2009; Zairi et al. 2009), яйца (Memarpoor-Yazdi et al. 2012) и  люди  (Bensch et al. 1995; Cunliffe and Mahida 2004; Godballe et al. 2011; Silverstein et al. 2007; Zasloff 2002). Насекомые выделяют такие пептиды в качестве  защитной иммунной реакции. Активные антимикробные пептиды, вырабатываемые  насекомыми  быстро уничтожают  инфекционные патогены, и считаются  компонентом самообороны (Du¨rr and Peschel 2002; Hoffmann et al. 1999; Kang et al. 2008; Taguchi et al. 2009).  С учетом  их повышенного  обилия, многие антимикробные  пептиды, такие, как  цекропин  With (Hoffmann et al. 1993), стомоксин, спингерин (Esteves et al. 2009; Kulkarni et al. 2011), саркотоксин IA (Matsuyama and Natori 1990) и другие были выделены  из различных видов  насекомых.  Педерус представляет собой род маленьких  жуков  семейства  Стафилиниды. Он получил название Педерус дерматит  из-за  токсинов в гемолимфе многих особей этого вида (Godballe et al. 2011). Род Педерус  широко распространен  по всему миру.  Благодаря тому, что они предпочитают  влажную почву, большое количество  жуков-пелерусов  привлекает  орошаемая аграрная земля, где они приносят  определенную  пользу, поедая травоядных насекомыхю Однако эти жуки  могут причинять проблемы  людям, работающим в полях  или на травяных площадках (Armstrong и Winfield 1969; Gnanaraj и др. 2007; Nicholls и др. 1990).  Педерус-дерматит широко распространен  в лугах провинций Голестана, Мазандарана и Гилана на севере Ирана
(Gelmett Grimalt 1993). Это насекомое  обладает  полным  метаморфозом  (полным  превращением), следовательно, антибактериальные  пептиды быстро  синтезировались  жировым телом и секретировались  в гемолимфу, что наблюдается у некоторых других насекомых (Bullet et al. 1999). Цель данного исследования заключалась в выделении  антимикробных пептидов  из Педериус-дерматита, а также  в том, чтобы охарактеризовать   самые активные пептиды.

Материалы и Методы

Материалы

Метиловый, этиловый  спирт, трифторуксусная кислота (TFA), ацетонитрил, уксусная кислота, хлористый натрий,  формальдегид, гидроокись  натрия,  трихлоруксусная кислота, ацетон, соляная кислота, приобретенные  от компании  «Merck and Company» Inc. (Whitehouse Station, NJ, USA). Mueller–Hinton BrothMHB), триптиказо-соевый бульон  (TSB) и среда  культуры кровяного  сахара были  приобретины  в  лаборатории «Himedia Laboratories». Анадитические и полупрепаративные  колонки были приобретены  в  компании  «Macherey–Nagel GmbH Co».  Все остальные использованные  химикаты,  включая  агар, метиловый зеленый, агарозу, бромфеноловый  синий, неионное поверхностно активное вещество «Triton X-100» (Dow Chemical Company, Midland, MI, USA), EDTA (этилендиаминтетраацетат) и  краситель кумасси бриллиантовый голубой R-250,  предназначались    для  аналитического  определения  чистоты.

Экстракция

В период с июня по июль, пятьсот  взрослых  жуков Педерусов  было собрано  в различных  частях   провинции Голестан  на северо-востоке Ирана. Собранные  насекомые  содержались  в маленьких  клетках  при нормальных  лабораторных  условиях при температуре 25 (±2) . Для  выделения  антимикробных  компонентов, насекомые  были заморожены в жидком азоте, а затем измельчены  в порошок  в присутствие  жидкого  азота. Полученный  порошок был  подвержен  подкислению дистиллированной  водой с содержанием  1 % трифторуксусной кислоты (TFA), а также  инкубированию  на протяжение  30  минут в ледяной   бане под воздействием  легкого встряхивания. После центрифугирования с центробежной скоростью  15, 0009 г на протяжении  30 минут, полученная надосадочная  жидкость  была  перенесена  в свежие сосуды  и лиофилизирована  для  выделения  антимикробных пептидов.

Очищение Антимикробных  Пептидов

Для выделения  антимикробных  пептидов, лифилизированный  экстракт (50 мг) растворили  в  1 мм  фосфатного  буфера  (5 мл, pH 6.0) с содержанием  5 мм Дигидрата двунатриевой соли (ЭДТА). Образец  был  подвержен  гелиевой  фильтрации «Sephadex G-50» со столбом (1 9 100 см), предварительно  кондиционированным  фосфатным   буфером  (0.1 M, pH 6.0). Элюирование проводилось  с использованием того же  буфера при скорости  тока жидкости 0.4 мл/мин. Мониторинг  абсорбации  элюируемых  пиков  осуществлялась при концентрации  280 нмоль  посредством  использования ультрафиолетового детектора. Все фракции  подлежали   концентрации, лифилизированию и анализу  для определения  основных  фракций с содержанием  антимикробных пептидов. Для дальнейшего очищения фракции  с антимикробной активностью были  растворены  в самом маленьком  объеме дистиллированной  воды  и подвергнуты  очищению  с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии  (RP-HPLC) на полупрепаративной  аналитической колонке С18  (10 9 250 мм). Впрыскиваемый  объем   составил  400мкл каждый раз. Мобильная  фаза  состояла  из элюента А (0.1 % трифторуксусная кислота (TFA) в дистилированной  воде (по объему)), и элюэнта B (0.098 % трифторуксусная кислота (TFA) в ацетонитриле). Элюирование проводилось  с использованием линейного  градиента 5–65 % элюента B  при скорости тока жидкости  1 мл/мин  на протяжение 70  минут.  В соответствие с  абсорбцией 220 нмоль, собирались  основные  пики, лиофилизировались  и оценивались  по антимикробной активности. Затем  проводилось  очищение наиболее  активных фракций посредством  использования  той же  процедуры, за исключением  элюирования, которое   проводилось  с использованием 0.5 %  увеличения  в минуту градиента раствора B. Для  оценки  чистоты, малое  количество каждого пика  проверялось  на аналитической колонке С18  (4.6 9 250  мм ) с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии  (RP-HPLC).

Анализ Антимикробной Активности

Анализ Радиальной Диффузии

Анализ  радиальной диффузии  использовался для определения  антимикробного воздействия на собранные пептиды в соответствие  с описанием  Асоодех (Asoodeh) и других. (2012). Для  проведения  первичных  анализов, использовались микроорганизмы, такие как: сенная палочка (PTCC4533), кишечная  палочка  (PTCC2433) и Penicillium lilacinum.  Аликвота   бактерии  с титром 4 9 106 CFU  смешивалась  со средой, состоящей  из  1 %  агорозы  и  0.03 %  триптон- соевым бульоном и заливалась в пластину. В среде  создавались  лунки  посредством   использования  щипцов. Пептидный  образезец  закладывался в плашки, а пластины подвергались  инкубированию  на протяжение 3  часов  при  температуре 37 °C. После 3-х часового  инкубирования  вторичная  среда  обогащалась 1 % агарозой, а 6 % триптон-соевый бульон   заливался  в пластины, а пластины  подвергались  инкубированию на протяжение 18 часов  при температуре 37 °C. Затем,  пластины окрашивались  на протяжение 24  часов, используя  раствор  с содержанием  37 % формальдегида , 15 мл; метанола, 27 мл; воды,63 мл; и  красителя кумасси бриллиантовый голубой R-250, 2 мг. Пластины подвергались  обесцвечиванию  приблизительно  на протяжение 10 мин  посредством  использования водного  раствора 2 % диметилсульфоксида и 10 % уксусной  кислоты. Антибиотик «Неомицин»   (15 мкг ) использовался  в качестве позитивного  контроля. Для  оценки противогрибковой  активности, один мл грибковой суспензии вносили  в 20 мл картофельного  агара с декстрозой и заливали в пластины с  микробными культура. Затем  при помощи   щипцов  в среде создавались лунки, и наполнялись  экстрактом из насекомых. Пластины подвергались  инкубированию  на протяжение 7 дней при   температуре 30–35°C, результаты записывались   на протяжение  всего  этого периода.

Определение  Минимальной Ингибирующей Концентрации

Величина  Минимальной  Ингибирующей Концентрации была определена, как  пептидная  концентрация, при которой  бактериальный  рост  ингибировался  после 24-х часового  инкубирования  при температуре 37 °C (Amiri et al. 2012; Asoodeh et al. 2012; Zardini et al. 2012). Сначала каждая бактерия  выращивалась  отдельно  в бульоне Мюллера-Хинтона на протяжение    18 часов  при температуре 37°C. Приблизительно 1 мл культуры  перенесли  в 9 мл бульонной  питательной  среды на 15 часов  при температуре  37°С, затем  корректировалась  клеточная  концентрация  для  получения  конечной концентрации 106 КОЕ/мл посредством  использования   Бульона Мюллера-Хинтона. 100 мкл бактериальной суспензии (1 9 106 КОЕ/мл) и 80 мкл среды  Бульона Мюллера-Хинтона наливали  в микропластину. Подготавливались исходные  серийные  разведения 1–32 мг/мл фракций, а к вышеупомянутому  Бульону Мюллера-Хинтона  добавляли 20 мкл фракционных  исходных культур для определения  конечной концентрации   105 КОЕ/мл  в каждой плашке. Микропластина  подвергалась   инкубированию  на протяжение  24 часов при температуре 37°C. Затем, абсорбция  каждой  плашки   определялась  при 630 нм  посредством  использования считывающего  аппарата для   твердофазного иммуноферментного анализа (ЭЛАЙЗА), а полученные  результаты  сравнивались  с контрольными  образцами. Чтобы определить  минимальную ингибирующую  концентрацию с грибковой  взаимосвязью, 180 мкл среды  сабуро-декстрозного  агара  с 10 мкл грибковой суспензии  (106 КОЕ/мл) и 10 мкл серийных  концентраций  экстракта  насекомых заливали в микропластины и подвергали  инкубированию на протяжение 24 часов  при температуре 37°С. Шесть  бактериальных  видов, включая кишечную палочку PTCC2433, пневмонии  Клебсиелла PTCC4231, Псевдомонас аэругиноза PTCC2834, сенную палочку PTCC4533, Золотистый стафилококк PTCC1442,  Восковую бациллу  PTCC1435, а также  три  грибковых вида: Аспергилл чёрный (Aspergilus niger), Аспергилл дымящийся (Aspergilus fumigates) и Кандида альбиканс (Candidate albicans) использовались  для определения  Минимальной Ингибирующей Концентрации. Все эксперименты проводились по три раза.

Определение Чистоты на Трицине-ДСН-ПААГ

Чтобы  оценить чистоту образца, 50 мкл каждого пика (0.5 мкг/мкл) проверяли на электрофорезе ДСН-ПААГ. Фракции, полученные в результате гелиевой  фильтрации и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии  (RP-HPLC )подвергались лиофилизированию и повторному  растворению  в дистиллированной  воде. Оценка  электрофоретического  образца фракции F6  и очищенных  пептидов (пептид 5, 9, 10) проводилась  посредством  использования  электрофореза  Трицин–ДСН–ПААГ (Schagger 2006). При этом использовались  6.5 % (масса/объем) концентрирующий  гель и двухсоставной (10 и 15 % (масса/объем)) разделяющий  гель.

Секвенирование  Пептидов

Тандемная масс-спектрометрия используется для секвенирования пептидов [Центр Молекулярной Биологии  Астбери  при Университете  в Лидсе]. Первый  анализатор  используется  для выбора определенных  пользователем  образцов ионов, появляющихся из определенного компонента. Эти  избранные  ионы поступают  в реакционную  ячейку столкновений  и бомбардируются  газовыми  молекулами, что  вызывает  формирование ионных осколков, а  эти  ионные  осколки  анализируются, т.е. отделяются в соответствии с  соотношением  их массы  к заряду  посредством  второго анализатора.  Все  ионные осколки  образуются  непосредственно  из  ионов- предшественников,  определенных в процессе   проведения эксперимента, таким образом, образуется  дактилоскопический  узор, характерный  для  исследуемого  компонента. Очищенные  пептиды повергались  восстановлению  посредством  применения  10 мкл  0.1 % трифторуксусной  кислоты (TFA) (по объему ). Аликвота  (1  мкл) каждого  пептидного  раствора  наносилась на шлифованную стальную пластину-мишень  для  MALDI масс-спектрометрии, сразу  после этого  наносился  равный  объем  свежеприготовленного 5 мг/мл раствора Альфа-Циано-4-Гидроксикоричной кислоты (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в 50 % водном  растворе (по объему) ацетонитрила  с содержанием  0.1 % трифторуксусной  кислоты (TFA) (по объему ). Аналитическое  программное  обеспечение « Bruker flex»(версия 3.3) использовалось  для проведения  спектральной обработки и генерации  пикового списка, как  для  масс- спекометрии  и тандемной  масс-спектрометрии. Независимый сиквенс проводился вручную, что  позволяет максимальную  массовую погрешность 0.5 Да   для любой  фрагментации  иона. Расшифрованные  серии  b-иона и y- иона накладывались  на спектр их  фрагментации  посредством  использования  аналитического  программного  обеспечения « Bruker flex» (версия 3.3).

Филогенетический  Анализ

Тринадцать  аминокислотных последовательностей  пептидов из различных насекомых  были получены  из базы данных  антимикробных  пептидов (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Эти  последовательности наряду с последовательностями  для  «Саркотоксина Пд» анализировались  посредством  использования  программного  обеспечения «Blast». Затем  анализ осуществлялся вручную. Филогенетическое  древо  было  получено посредством  аналитической  программы tree «CLC main workbench» Версия.5.5 software (CLC bio A/S, Denmark)  путем   использования метода объединения соседних пар. Бутстрэп  анализ  с  100 репликаций  проводился на филогенетическом  древе для оценки  репродуктивности  древовидной  топологической  схемы.

Проба на гемолитические  бляшки

Гемолитическая  активность  «саркотоксина Пд» определялась  посредством  использования свежих  человеческих  эритроцитов  по методу  Асоодех (Asoodeh) и других. (2012). Вкратце:  свежая человеческая кровь (5 мл) была  добавлена в гепаринизированную  пробирку,  а затем  подвержена  центрифугированию с центробежным  ускорением 7,0009 г  на протяжение  5 минут. Выделившиеся  красные  кровяные тельца  промывались  пять раз  с использованием 4мл  стерильного фосфатно-солевого  буфера (ФСБ) и  подвергнуты центрифугированию с центробежным  ускорением  7,0009г  до тех  пор,  пока растворы не становились  прозрачными. В конце концов, красные  кровяные тельца  растворяли в фосфатно-солевом  буфера (ФСБ)  (20 мл). Гемолитическая активность оценивалась  посредством использования выброса гемоглобина в пластины с кровяным  агаром, определенные  чистой  зоной вокруг плашек. Для оценки гемолитической  активности, серийно разведенные образцы пептидов  помещались в микроцентрифужные  пробирки, в  которых содержалось 190 мкл  разведенных  красны  кровяных телец (10 % телец). После инкубирования  на протяжение  30  мин при  температуре  37°C, пробирки  подвергались центрифугированию с центробежным  ускорением 8, 0009г  на протяжение 5 мин. Аликвота  осветленного раствора (100 мкл)  была удалена , а затем  разведена фосфатно-солевым  буфером (ФСБ) до окончательного  объема  в 1 мл . После всего, абсорбция регистрировалась  при  567 при нм. Гемолитический эффект  проявлялся в качестве чистой зоны  вокруг плашек.  Нейтральный детергент «Triton X-100» использовался в качестве положительного  контроля  для сравнения гемолитического эффекта  определенных  пептидов.

 

 Рис. 1 a Фильтрация гелем  «Sephadex G-50» лиофилизированного  порошка, приготовленного из  педерус  дерматита. Фильтрация  проводилась  на  колонке «Sephadex G-50» в равновесии  с  фосфатно-солевым  буфером (0.1 M, pH 6.0). Самая потенциальная  антимикробная  фракция была названа  F6 фракция, выделенная кругом. Антимикробная  активность F6 фракции  против плесневого  гриба Penicillium lilacinum (b), Кишечной палочки  (c), и сенной палочки (d)

 А) Абсорбция  (280 нм)

Время  (мин)

В) ПлесневоЙ  гриб Penicillium lilacinum

С)  Кишечная  палочка

D) Сенная палочка

Пептидный  Синтез

Выявленные пептиды синтезировались 9-флуоренилметоксикарбонилом в твердом состоянии  посредством  использования  пептидного синтезатора «Applied Biosystems Model 432A Synergy». Синтетические пептиды подвергались  очищению  посредством  использования обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) на полупрепаративной  аналитической колонке С18 (10 9 250 мм). Колонка проявлялась  с линейной  скоростью потока  2 мл/мин линейным  градиентом  ацетонитрила  (5–45 %  на протяжение 40 минут ) с  содержанием  0.1 % трифторуксусной  кислоты (TFA).

Результаты

Очищение  и  Антимикробный  Анализ

Из 500 взрослых особей  жуков Падерус-дерматит было  получено 50 мг лиофилизированного порошка. Первый этап  фракционирования  лиофилизированного порошка на колонке гель фильтрации  позволял  эффективно  осуществить  отделение  восьми  фракций (Рис. 1a). Антимикробная активность   каждой  фракции  анализировалась  посредством  использования метода радикальной диффузии. Как  показано  на прилагаемых   рисунках 1b, c и d,  F6 фракция  проявила  антимикробную  активность  против трех  патогенных микроорганизмов(плесневого  гриба (Penicillium lilacinum), Кишечной палочки , а также сенной палочки,).  Чистота этой  фракции, которая  в основном состояла  из белков  и пептидов   с молекулярной  массой  ниже  18 кДа (Рис. 2)  оценивалась на электрофорезе ДСН-ПААГ.  F6  фракция  была  более очищенной  посредством  использования обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) и получены одиннадцать  простых фракций  (Рис. 3a). Фракции  были пронумерованы  в порядке  последовательности. (Рис. 3a). Результаты  антимикробных  анализов  показали, что  полученные фракции  являются  эффективными   против девяти  патогенных  микроорганизмов (Рис 4). Антимикробная  активность  этих  фракций  намного   больше, чем антимикробная  активность 15 мкг неомицина, используемого в качестве контроля. Антимикробная  активность  F8*, F9 и F10 фракций  больше антимикробной  активности  других фракций. Согласно  результатам  электрофореза  Трицин–ДСН–ПААГ, обнаружено, что  F8* фракция  была  абсолютно  чистой, в то время, как во  фракциях F9 и F10  содержалось два  и три пептида, соответственно  (Рис. 2). Следовательно F9 и F10 фракции были  более очищенными  при использовании  одинаковых условий, за исключением  использования градиента 0.5 % элюента B в минуту. Самые активные  пептиды  обозначены  стрелочкой (Рис. 3b, c).

Рис 2 Электрофорез Трицин–ДСН–ПААГ  фракции F6  в результате гелиевой фильтрации (1), F10 фракция (2), F9 фракция (3) и F8* фракция (4)  в результате обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) на  аналитической колонке С18 и маркер  размера (5). a, 35 кД; b, 18 кД; c, 14 кД; d, 5.8 Кд и e, 2.2кД

Рис.3 a Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (RP-HPLC) F6 фракции, полученная  в результате  гелиевой  фильтрации «Sephadex G-50». Аликвота  фильтрованного  экстракта (400 мкл)  в результате  гелиевой  фильтрации  была загружена  на  полупрепаративную обращенно-фазовую   аналитическую колонку С18. Активные  фракции (F8*, F9 и F10) обозначены звездочкой. Самые активные  фракции  F9 и F10,  являются  более  очищенными  посредством  использования обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) (b и c). Самые активные пептиды  обозначены  стрелочкой.

Структурная Характеристика

Три антимикробных пептида, помеченные  звездочкой  на  Рис.3a, были  подвержены анализу аминокислотной  последовательности, посредством  использования анализа тандемной спектрометрии. Рис.5 демонстрирует  анализ  тандемной  спектрометрии  для F6 фракции. Определенные  аминокислотные последовательности, теоретические  и экспериментальные  молекулярные  массы, а также  рассчитанные изоэлектрические  точки очищенных пептидов  приведены в Таблице 1. Сравнение  пептидных  последовательностей  и других, опубликованных  последовательностей антимикробных пептидов, показало, что  пептиды F8* и F10  были   идентичны   цекропину C и   цекропину D (иммунный  белок  насекомых), соответственно.  В то время, как  пептид  F9  не проявил гомологии  последовательности  к какому-либо  антимикробному пептиду  в базе данных, что позволяет  предположить, что данный пептид   представляет   собой  новый антимикробный пептид. Новый идентифицированный  антимикробный  пептид был назван  «Саркотоксин Пд» на основе систематической  номенклатуры  для антимикробных пептидов (J. Michael 2008). Наблюдаемая  масса «Саркотоксина Пд» составила  3613.26, что  соответствует  теоретической  массе (3613.265 Дa). Аминокислотный состав этого пептида был  идентифицирован, как:  GWLKKIGKKIERVGQHTRGLGIAQI AANVAATAR (Таблица 1). В последовательности  пептида  «Саркотоксин Пд» присутствует  большое   количество  базовых  аминокислот, что обнаружено  в других антимикробных пептидах. Анализ  посредством  использования  инструмента   «ExPASy MW/pI» (http://www.expasy.ch/tools/pi-tool.html) выявил, что у пептида «Саркотоксин Пд» была  предсказуемая  изоэлектрическая  точка, величина  которой  составила 11.8. Следовательно, «Саркотоксин Пд», как  новый антимикробный пептид  был  выбран  для определения  минимальной  ингибирующей концентрации и анализа  гемолиза.

Рис. 4 Антимикробная  активность  очищенных  пептидов  против  бактерий  и грибков посредством  использования  метода  радикальной  диффузии  (зона  ингибирования). Диаметр  не растущего  ореола  измерялся  и отображался, как диаграмма. Антимикробная активность этих  пиков  намного больше, чем  15 мкг неомицина.

Рис. 5 Определение  молекулярной  массы  аминокислотной  последовательности  для пептида F6, посредством  использования спектрометра MALDI-TOF (время-пролётная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы. Тандемная  масс-спектрометрия пептида F6 и интерпретация полученного  спектра.

Таблица 1 Первичная структура, молекулярный вес и величины изоэлектрической точки пептидов, полученных  из Педерус дерматита.

Определение  Величины  Минимальной  Ингибиторной  Концентрации

Анализ  антимикробной  активности путем оценивания величины минимальной ингибиторной концентрации проводился  на грибах, грамположительных и грамотрицательных бактериях  (Таблица 2).  «Саркотоксин Пд»  продемонстрировал  более  высокую  эффективность  против грамотрицательных   бактерий, чем  против  грамположительных бактерий и грибов. Среди  протестированных микроорганизмов, пневмония клебсиелла, кишечная палочка  были   самыми чувствительными  к пептиду  «Саркотоксин Пд». Величины  минимальной ингибиторной концентрации  пептида «Саркотоксин Пд» против  пневмонии  клебсиелла  и  кишечной  палочки  составляли 6.25  и 6.12 мкг/мл, соответственно.

Таблица 2 Величины  минимальной ингибиторной концентрации  пептида «Саркотоксин Пд» против  различных микробов

а  Концентрация  антимикробного  пептида для ингибирования   бактериального  или грибкового  роста  спустя  24  часа  при температуре 37° C

Данный пептид   был также  активен  против  исследуемых  фитопатогенных грибов, поэтому общее  подавление  грибкового роста  Аспергилла черного, Аспергилла дымящегося  и Кандида альбиканс   наблюдалось  при концентрациях  25.2, 22.3 и 18.62 мкг/мл, соответственно.

Филогенетический Анализ

Множественное выравнивание последовательностей  пептида «Саркотоксин Пд» проводилось   посредством  13  стандартизированных антимикробных пептидов,  полученных из базы данных  антимикробных пептидов. Результаты использования программы «BLAST» для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания, продемонстрировали, что  «Саркотоксин Пд» обладает  высокой  гомологией  наравне  с  пептидом «Саркотоксин IA», полученным  от дрозофилы  фруктовой  (Рис. 6a). Филогенетический  анализ  аминокислотных последовательностей  проводился  посредством  создания  филогенетического  древа. Основываясь  на длине  линий  на филогенетическом  древе, пептид «Саркотоксин IA», полученный  от дрозофилы  фруктовой  и пептид «Саркотоксин IC», полученный  от мясной  мухи  продемонстрировали  высочайшее  сходство  с  пептидом  «Саркотоксин Пд» (Рис. 6b). Данные  пептиды  продемонстрировали   идентичность на 84.61 % и 79.48 %  с пептидом  «Саркотоксин Пд», соответственно. Кроме того, при сходстве  на 36.82 % и 35.54 %, спингерин и цератотоксин   обладали   самой  низкой  гомологией в сравнении  с  пептидом «Саркотоксин Пд».  Несмотря  на  эти сходства,  пептид  «Саркотоксин Пд»  можно считать  новым членом  семейства   цекропина.

Данное  исследование

Рис. 6 a Выравнивание пептида «Саркотоксин Пд» с другими антимикробными пептидами, полученными  от различных  насекомых. Выравнивание  проводилось  посредством  использования   программного  обеспечения «CLC Main Work Bench Ver.5.5». b Филогенетическое древо  пептида «Саркотоксин Пд». Аминокислотные последовательности 13 стандартизированных  пептидов, полученных  из базы данных  антимикробных пептидов  были внесены  на древо  посредством  использования метода объединения  соседних  пар. Наименование  каждой  последовательности печатается  в конце  соответствующей ветви. Достоверность  древа оценивалась посредством проведения бутстрэп-анализа с 100 репликаций.
При замещениях, аминокислотная  позиция  печатается над  каждой  ветвью.

Гемолиз (%)

Концентрация  пептида «Саркотоксин Пд» (мкг/мл)

Рис. 7 Гемолитическая  активность пептида «Саркотоксин Пд»  выделенного из падерус дерматита. Прилагаемая иллюстрация показывает, что анализ  гемолитической  активности  пептида  «Саркотоксин Пд»  в диапазоне   5–100 мкг/мл, основанный  на методе  радикальной  диффузии (1 фосфатно-солевой буфер, 2 5 мкг/мл, 3 10 мкг/мл, 4 20 мкг/мл, 5 40 мкг/мл, 6 60, 780 мкг/мл, 8 100 мкг/мл  и  9 Triton X-100)

Оценка Гемолитической  Активности

 Для  будущего  применения  в терапевтических  целях, тестировалась  гемолитическая  активность  пептида «Саркотоксин Пд» по отношению к красным  кровяным   тельцам   человека.  Пептид  «Сакотоксин Пд» не  обладал  значительным  гемолитическим   эффектом в диапазоне  концентраций (5–100 мкг/мл), используемых  для  теста радикальной   диффузии  (Рис. 7,прилагается). Как показано  на Рис. 7,  пептид  «Саркотоксин Пд»  продемонстрировал  умеренную  гемолитическую   активность, вызывая  только 10 % гемолиза  красных  кровяных  телец человека,  при  концентрации  100 мкг/мл.  Наблюдалось,  что  пептид «Саркотоксин Пд»  обладал  малым  гемолитическим  эффектом,  порядка   его величин  минимальной  ингибиторной концентрации (≤30 мкг/мл), указывая на слабое  взаимодействие  между пептидами  и фосфолипидами красных  кровяных  телец.

Пептидный  Синтез

Идентифицированные  пептиды   синтезировались 9-флуоренилметоксикарбонилом в твердом состоянии  посредством  использования  пептидного синтезатора «Applied Biosystems Model 432A Synergy». 5 мг пептида   было получено именно  этим синтетическим  способом.  Синтетический  пептид  также  демонстрирует  соответствующую  антимикробную  активность, также как и естественный  пептид. Эти данные  не представлены.

Обсуждение

Антимикробные пептиды (АМП) являются  ключевыми  факторами в иммунной  реакции  насекомых  против инвазивных микроорганизмов. Антимикробные  пептиды, как правило, представляют собой 12–50 аминокислот  в длину с суммарным  зарядом  благодаря  избытку остатков   основной аминокислоты  (Hancock and Chapple 1999; Hancock и Diamond 2000). Самым  избыточным  семейством  линейных  антимикробных пептидов инсектицидного происхождения являются  цекропины, включая саркотоксины, сподопсин, гифансин, энбоцин, а  также  цекропиноподобные молекулы (Bullet  и другие. 2003; Bullet и другие. 1999).   При проведении данного  исследования, новый  антимикробный  пептид, полученный  из Педериус  дерматита, подвергался  очищению  и анализу. Предыдущие  исследования зависимости от структуры дают основания  предполагать, что антимикробная активность  антимикробных  пептидов характеризуется  значительной  зависимостью  от  их а-спиральной структуры, которая  находится  под  влиянием заряда, размера, спиральности, гидрофобного момента, гидрофобности   (Tossi  и другие. 2000).  Идентифицированный   антимикробный  пептид   состоит из 34  остатков  аминокислот с суммарным  зарядом  +7, (сгруппированных в позициях 4, 5, 8, 9, 12, 18 и 34). Общее  гидрофобное  соотношение этого пептида  составляет 45 % (Boman 1991; Lu и другие. 2006; Rees и другие. 1997; Shao и другие. 2004). Выравнивание последовательностей антимикробных пептидов  отображает поразительное  сходство  между частями  этого  гидрофобно-катионного  пептида  и саркотоксина IA (Katarina и другие. 2002), саркотоксина IC (Kulkarni и другие. 2011), а также саркотоксина IB (Lauth и другие. 1998),  как показано на рисунке  6a. Кроме того,  отмечается  сходство  последовательности с  амфибийным  антимикробным семейством цекропинов.  Следовательно, идентифицированный  пептид является членом семейства цекропинов, и он получил  свое  название  «Саркотоксин Пд» в соответствие  с номенклатурной  рекомендацией   Колона  (Conlon) (2008). Изначально  цекропии   находятся  у насекомых рода чешуекрылых  —  Павлиноглазка  Цекропия (Steiner и  другие. 1981). «Саркотоксин Пд» обладает  обширной  антимикробной активностью  против грамотрицательных и грамположительных  бактерий, а также грибов. Предварительно  установлено, что цекропины  содержат в себе  две  а-спирали, что приводит к проявлению  их антимикробной  активности  против  грамотрицательных бактерий. Как  и другие  члены семейства  цекропинов, «Саркотоксин Пд» является  более  эффективным  против грамотрицательных  бактерий  (Yang  и другие. 1999). В соответствие  с этими наблюдениями, а также  согласно предыдущих  исследований, сделан  вывод, что «Саркотоксин Пд» имеет  а-спиральную  структуру (Bullet et al. 1999). Гидрофобный характер  пептида  «Саркотоксин Пд» оправдывается  тем,  что его положительная средняя  гидропатичность  играет  важную роль во взаимодействии  микробной  мембраны. Установлено, что  пептид «Саркотоксин IA» обладал двумя амфифильными  спиралями с двумя гидрофильными и гидрофобными  поверхностями (Iwai и другие.1993). Как показано на Рис 8, сравнение аминокислотной  последовательности  пептида  «Саркотоксин Пд»  и «Саркотоксин IA»  предполагает   присутствие N-терминальной обоих пептидов (Iwai  и другие. 1993). Пептидная  структура  прогнозировано основывалась на структуре пептида  « Саркотоксин  IA». В данной предсказанной  структуре, ее  боковые цепи находятся в амфифильном расположении  со всеми заряженными  остатками  аминокислот, отсепарированных на одну поверхность спирали (Рис. 8). Этот новый  пептид  может образовывать  а-спарали приблизительно  с 14 остатками аминокислот на той же самой  гидрофобной  поверхности.  Величины минимальной  ингибиторной  концентрации  пептида  «Саркотоксин Пд» подвергались  сравнению с другими очищенными антимикробными пептидами, полученными  от различных насекомых. Величины минимальной  ингибиторной  концентрации  пептида  «Саркотоксин Пд» ниже, чем  у пептидов «санатин» (Romanelli и другие. 2011), «дросоцин» (Bullet и другие. 1996), «дефенсин» (Lauth и другие. 1998),  а также пептид «Gm цекропин  D (Hwang и другие. 2009). Кроме того,  гемолитическая активность пептида «Даркотоксин Пд»  была   на 10 % ниже по сравнению с некоторыми  идентифицированными антимикробными  пептидами, такими, как  «декоралин» (15 %) (Baek и другие. 2011) и «желейный»  (11 %) (Romanelli  и другие. 2011). Примечательно, что  идентифицированный пептид с низкой  гемолитической  и антимикробной  активностью  широкого  спектра, может быть  полезным  при лечении  патогенных заболеваний.  Тем не менее, необходимо  провести  более  подробные исследования его антимикробной активности путем  проведения опытов in vivo.

Прогнозируемая  диаграмма  пептида «Саркотоксин Пд» в виде  спирального колеса.

Список  благодарностей: Авторы хотят выразить  благодарность Клубу  Молодых  Исследователей при Исламистском  Университете «Azad», «Yazd», за  финансовую  поддержку Ирана.

 Список  Литературы:

Amiri A, Zare Zardini H, Shanbedi M, Maghrebi M, Baniadam M (2012) Efficient method for functionalization of carbon nanotubes by lysine and improved antimicrobial activity and waterdispersion. Mater Lett 72:153–156

Armstrong RK, Winfield JL (1969) Paederus fuscipes dermatitis. AmJ Trop Med Hyg 18:147–150

Asoodeh A, Zare Zardini H, Chamani J (2012) Identification and characterization of two novel antimicrobial peptides, temporinRa and temporin-Rb, from skin secretions of the marsh frog (Rana ridibunda). J Pepet Sci 18:10–16

Baek JH, Ji Y, Shin JS, Lee S, Lee SH (2011) Venom peptides from solitary hunting wasps induce feeding disorder in lepidopteran larvae. Peptides 32:568–572

Bensch KW, Raida M, Mgert HJ, Schulz-Knappe P, Forssmann W-G (1995) hBD-1: a novel a-defensin from human plasma. FEBS Lett 368:331–335

Boman HG (1991) Antibacterial peptides: key components needed in immunity. Cell 65:205–207

Boman HG (1995) Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu Rev Immunol 13:61–92

Boman HG (2003) Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. J Intern Med 254:197–215

Bullet P, Urge L, Ohresser S, Hetru C, Otvos L (1996) Enlarged scale chemical synthesis and range of activity of drosocin, an O-glycosylated antibacterial peptide of drosophila. Eur J Biochem 238:64–69

Bullet P, Hetru C, Dimarcq JL, Hoffmann D (1999) Antimicrobial peptides in insects; structure and function. Dev Comp Immunol 23:329–344

Bullet P, Charlet M, Hetru C (2003) In: Ezekowitz RAB, Hoffmann JA (eds) In innate immunity. Humana Press, Totowa, pp 89–107

Conlon JM (2008) Reflections on a systematic nomenclature for antimicrobial peptides from the skins of frogs of the family Ranidae. Peptides 29:1815–1819 Cunliffe RN, Mahida YR (2004) Expression and regulation of antimicrobial peptides in the gastrointestinal tract. J Leukoc Biol 75:49–58

Du¨rr M, Peschel A (2002) Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun 70:6515–6517

Esteves E, Fogac¸a AC, Maldonado R, Silva FD, Manso PP, PelajoMachado M, Valle D, Daffre S (2009) Antimicrobial activity in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs: cellular localization and temporal expression of microplusin during oogenesis and embryogenesis. Dev Comp Immunol 33:913–919

Gelmetti C, Grimalt R (1993) Paederus dermatitis: an easy diagnosable but misdiagnosed eruption. Eur J Pediatr 152:6–8

Gnanaraj P, Venugopal V, Mozhi MK, Pandurangan CN (2007) An outbreak of Paederus dermatitis in a suburban hospital in South India: a report of 123 cases and review of literature. J Am Acad Dermatol 57:297–300

Godballe T, Nilsson LL, Petersen PD, Jenssen H (2011) Antimicrobial b-peptides and a-peptoids. Chem Biol Drug Des 77:107–116

Hancock REW, Chapple DS (1999) Peptide antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 43:1317–1323

Hancock REW, Diamond G (2000) The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol 8:402–410

Hancock REW, Sahl HG (2006) Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat Biotech 24:1551–1557

Hoffmann JA, Hetru C, Reichhart J-M (1993) The humoral antibacterial response of Drosophila. FEBS Lett 325:63–66

Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA, Ezekowitz RAB (1999) Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science 284: 1313–1318

Hwang JS, Lee J, Kim YJ, Bang HS, Yun EY, Kim SR, Suh HJ, Kang BR, Nam SH, Jeon JP, Kim I, Lee DG (2009) Isolation and characterization of a defensin-like peptide (coprisin) from the dung beetle, Copris tripartitus. Int J Pept 2009:136284 Iwai H, Nakajima Y, Natori S, Arata Y, Shimada I (1993) Solution conformation of an antibacterial peptide, sarcotoxin IA, as determined by 1H-NMR. Eur J Biochem 217:639–644

Kang C, Son SY, Bang I (2008) Biologically active and C-amidated hinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli. J Microbiol 46:656–661

Kang JK, Hwang JS, Nam HJ, Ahn KJ, Seok H, Kim S-K, Yun EY, Pothoulakis C, Lamont JT, Kim H (2011) The insect peptide Coprisin prevents clostridium difficile-mediated acute inflammation and mucosal damage through selective antimicrobial activity. Antimicrob Agents Chemother 55:4850–4857

Katarina B, Jaroslav K, Jan K, Jozef S (2002) Identification of honeybee peptide active against Paenibacillus larvae larvae through bacterial growth-inhibition assay on polyacrylamide gel.Apidologie 33:259–269

Kulkarni MM, Barbi J, McMaster WR, Gallo RL, Satoskar AR, McGwire BS (2011) Mammalian antimicrobial peptide influences control of cutaneous Leishmania infection. Cell Microbiol 13:913–923

Lauth X, Nesin A, Briand JP, Roussel JP, Hetru C (1998) Isolation, characterization and chemical synthesis of a new insect defensin from Chironomus plumosus (Diptera). Insect Biochem Molec 28:1059–1066 Lu Y, Li J, Yu H, Xu X, Liang J, Tian Y, Ma D, Lin G, Huang G, Lai R (2006) Two families of antimicrobial peptides with multiple functions from skin of rufous-spotted torrent frog, Amolops loloensis. Peptides 27:3085–3091

Manners JM (2009) Primitive defence: the MiAMP1 antimicrobial peptide family. Plant Mol Biol Rep 27:237–242

Matsuyama K, Natori S (1990) Mode of action of sapecin, a novel antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly). J Biochem-Tokyo 108:128–132

Memarpoor-Yazdi M, Asoodeh A, Chamani J (2012) A novel antioxidant and antimicrobial peptide from hen egg white lysozyme hydrolysates. J Funct Foods 4:278–286

Montan˜o AM, Tsujino F, Takahata N, Satta Y (2011) Evolutionary origin of peptidoglycan recognition proteins in vertebrate innate immune system. BMC Evol Biol 11:1471–2148

Nicholls DS, Christmas TI, Greig DE (1990) Oedemerid blister beetle dermatosis: a review. J Am Acad Dermatol 22:815–819

Rees JA, Moniatte M, Bullet P (1997) Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, apoidea). Insect Biochem Molec 27:413–422

Romanelli A, Moggio L, Montella RC, Campiglia P, Iannaccone M, Capuano F, Pedone C, Capparelli R (2011) Peptides from Royal Jelly: studies on the antimicrobial activity of jelleins, jelleins analogs and synergy with temporins. J Pepet Sci 17:348–352

Schagger H (2006) Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc 1:16–22

Shao Z-Y, Mao H-X, Fu W-J, Ono M, Wang D-S, Bonizzoni M, Zhang Y-P (2004) Genetic structure of Asian populations of Bombus ignitus (Hymenoptera: Apidae). J Hered 95:46–52

Silverstein KA, Moskal WA Jr, Wu HC, Underwood BA, Graham MA, Town CD, VandenBosch KA (2007) Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been underpredicted in plants. Plant J 51:262–280

Steiner H, Hultmark D, Engstrom A, Bennich H, Boman HG (1981)

Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 292:246–248

Taguchi S, Mita K, Ichinohe K, Hashimoto S (2009) Targeted engineering of the antibacterial peptide apidaecin, based on an in vivo monitoring assay system. Appl Environ Microbiol 75: 1460–1464

Toke O (2005) Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Pept Sci 80:717–735

Tossi A, Sandri L, Giangaspero A (2000) Amphipathic, a-helical antimicrobial peptides. Pept Sci 55:4–30

Wang H, Lu Y, Zhang X, Hu Y, Yu H, Liu J, Sun J (2009) The novel antimicrobial peptides from skin of Chinese broad-folded frog, Hylarana latouchii (Anura:Ranidae). Peptides 30:273–282

Yang J, Furukawa S, Sagisaka A, Ishibashi J, Taniai K, Shono T, Yamakawa M (1999) cDNA cloning and gene expression of cecropin D, an antibacterial protein in the silkworm, Bombyx mori. Comp Biochem Physiol B 122:409–414 Zairi A, Tangy F, Bouassida K, Hani K (2009) Dermaseptins and magainins: antimicrobial peptides from frogs’ skin-new sources for a promising spermicides microbicides. J Biomed Biotechnol 2009:452567

Zardini HZ, Amiri A, Shanbedi M, Maghrebi M, Baniadam M (2012) Enhanced antibacterial activity of amino acids-functionalized multi walled carbon nanotubes by a simple method. Colloid SurfAce B 92:196–202

Zasloff M (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415:389–395

Перевод с Английского, статья представлена  на данном сайте не в коммерческих целях. Авторское право принадлежит авторам  статьи.

Международная издательская компания Springer


Создание сайта: студия Сергея Каминского © 2012 —2019 amaliy.com все права защищены