Александр Малый
Доктор остеопат
и врач народной медицины
   
 
Доктор Александр Малый Задать вопрос доктору

Исследование механизма действия педерина

 Из Международной Лаборатории  Генетики  и Биофизики при  Университете Павия

Краткое   Содержание

Педерин  — это лекарственный  препарат, получаемый из жуков  рода  Стафилиниды-синекрылы (coleopter Paederus fuscipes). Данный препарат  ингибирует  рост  клеточных линий, культивированных  в лабораторных  условиях при концентрации  приблизительно равной 1.5 нанограм/мл. Цитологическое  исследование  демонстрирует генерализованный цитотоксический эффект. Анализ макромолекулярного  синтеза  посредством использования радиоактивных  предшественников показывает, что педерин   вызывает  почти немедленное  блокирование белка и ДНК синтеза, при этом, не оказывая влияния на РНК  синтез. Влияние  на синтез двух типов  макромолекул  остается  практически  одновременным даже при самых низких  активных концентрациях  педерина. Исследования  с использованием  безклеточных систем  показывают, что данный  препарат  ингибирует белковый  синтез и в тоже  время он не оказывает  никакого  эффекта на  ДНК- полемизирующую активность.  Таким образом, складывается впечатление, что данный  препарат  действует  прежде всего на  полемизирующую систему амино кислот, а влияние  на ДНК является  второстепенным. Такая  идея  подкрепляется  наблюдением, которое заключается  в том, что пуромицин, являющийся  специфическим ингибитором  белкового синтеза   быстро оказывает влияние  на синтез ДНК  в  искусственно  культивированных  клетках. Другие  авторы продемонстрировали такой же феномен  с применением  большого количества  ингибиторов   белкового синтеза;  таким образом,  свойства педерина  поддерживают  мнение  о том, что постоянный  белковый синтез необходим  для обеспечения репликации  ДНК у высших  организмов.

Вступление

Педерин  представляет собой ядовитое  вещество, полученное  из насекомых рода Стафилиниды-синекрылы (coleopter Paederus fuscipes), затем  данное вещество подвергалось очищению  до кристаллического   состояния Паваном  и Бо (1). Химическая  структура  данного вещества  продемонстрирована  на рис. 1. Химическая структура  была   определена  Кардани  и  другими (Cardani et al). (2),  а ее  самые   релевантные  биологические  эффекты были  описаны   профессором  Паваном (3). Предыдущие проведенные  эксперименты продемонстрировали значительную  токсическую активность препарата  на животных и растениях: Летальная доза LD50  для мышей, крыс  и морских  свинок  составляет порядком 2 мкг на 100 г  веса  тела; на искусственно выращенных культурах  клеток HeLa, концентрации порядка 1 нг/мл (1 нанограмм = 10- 9 г) вызывает  выраженное угнетение  клеточного  роста (4); 0.5 мкг/мл  педерина вызывает  сильное  угнетение  прорастания семян  Люпина  белого  и  вызывает метафазное  блокирование при клеточном  делении меристемы  корневого кончика репчатого  лука  (3). Поразительная  токсичность этого вещества побудила  к проведению более детального исследования  механизма его действия  для того, чтобы определить первичную локализацию  действия препарата. Данная  работа  посвящена  изучению токсичности  препарата на нескольких  клеточных линиях искусственного  культивирования, описанию  значимых цитологических эффектов, вызванных  его действием и экспериментам , которые демонстрируют что данное вещество  действует преимущественно  на  белковый синтез.

Материалы  и методы             

Реагенты

Кристаллическая обработка педерина использовалась  во время проведения экспериментов;  препарат подлежал  растворению в воде, обращая внимание на то, что  уровень pH  был  почти нейтральным с точки зрения кислотонеустойчивости препарата. Меченый тритием тимидин (833 кл/моль) и уридин  (500 кл/моль) были закуплены  в компании  «Radio-chemical Centre», в Амстердаме, Англии; лейцин-14 C (83 кл/моль) и фенилаланин  (366 кл/моль)  в  компании « New England Nuclear Corp»., в  Бостоне; пуромицин и  митомицин   представляли  продукцию  компаний «Nutritional Biochemical Corp»., в городе  Кливленд  и «Sigma Chemical Co»., в городе Сент-Луис, соответветственно.

Клеточные  линии  или  проведение  процедур  с линиями  и культурами

Минимальная  ингибиторная  концентрация  пелерина  определялась на гетероплоидных  линях клеток и диплоидных  линиях.  Все остальные эксперименты  проводились  только  с EUE линией.

Клеточные  штаммы  

EUE: клеточная  линия  человека, выделенная  Терни (Terni) и Ло Монако (Lo Monaco) (5).

E6D:    клональня  сублиния  клеток  EUE с  дефицитом  щелочной фосфатазы, отделенная  Де Карли  (De Carli)  и другими. (6).

HeLa:  Гей (Gey)  и  другие. (7).

Hep 2: Фельде (Fjelde (8).

Структура  педерина  по Кардани (Cardani et al. (2).

AS: клеточная  линия выделенная  из подкожной ткани  пациента с  Синдромом  Дауна, и  сохранявшаяся  в нашей  лаборатории  на  протяжении 4 лет.

MEF: клеточная  линия, выделенная в 1964 году  из  эмбриона  мыши Доктором  Мёрси в Исследовательских Лабораториях  компании «Lepetit Corporation», Милан, Италия.

37 RC: псевдодиплоидная  клеточная линия, выделенная  из  почечной  ткани мартышки   Нуццо и другими  (Nuzzo et al. 9).

KB:  Игл (Eagle  (10).

BHK 21:  Стокер и  МакФерсон (Stoker and MacPherson)  (11).

Клеточные штаммы

Z 1: Штамм диплоидной клетки получен из щитовидной железы человека, и выращивался  в нашей  лаборатории  на  протяжении 5  месяцев.

M 1:  штамм диплоидной  клетки  получен из человеческого  амниона, и  выращивался  в нашей лаборатории  на протяжении  6 месяцев.

Штаммы всех  клеточных линий  (за исключением  BHK 21 и MEF) выращивались в лактальбумине  (сбалансированный  соляной  раствор Хенкса , 5 мг/мл гидролизата  лактальбумина , 50 мкг/мл дрожжевого экстракта ); BHK 21, MEF,  а  также  диплоидные  штаммы выращивались  в среде Игла (12). Обе среды  были обогащены 10% телячьей сывороткой. Во время  проведения  всех экспериментов  все клетки  выращивались  в среде Игла  при температуре 37°C.

Тесты  на токсичность

Каждая  клеточная линия  или штамм  подвергались воздействию концентраций  педерина: двойного  разведения, в  пределах 100 и 0.3 нг/мл. Клетки  высеивались в 5-мл флаконы  с закручивающейся  крышкой (A. Thomas Co., Philadelphia), в которых  содержалось  2 мл среды  Игла. Размер  инокулята  составлял  5 X 104 клеток на флакон. Клетки приклеившиеся  ко дну  флаконов  инкубировались  при   температуре 37°C на  протяжении 4 дней, параллельно  с контрольными   без  педерина. По  окончанию этого срока  регистрировалась самая  низкая  концентрация  педерина, которая  вызывала тотальное  угнетение  клеточного роста.

Цитологические  исследования

Клетки,  выращенные на дне   5-мл флаконов  с закручивающейся  крышкой подвергались  отслаиванию  при помощи  раствора трипсина 2 .5-мг/мл  (Difco, Детройт, 1:250). После  гипотонической  обработки  1% раствором натрий  цитрата, а также предварительного  закрепления  несколькими каплями раствора  метилового спирта  с уксусной  кислотой  по  объему 3:1, клетки  фиксировались  одним  и тем же реагентом  на протяжении 10  минут;  а затем наносились на  предметные  стекла, предварительно смоченные 0.1%  раствором  Гемосола (Dade Reagents Inc., Майами).  Предметные  стекла высушивались  на воздухе, пропитывались  раствором  «Giemsa» (E. Merck Ag., Darmstadt,Германия),  а затем обрабатывались  эупаралом  (Chroma Gesellschaft, Stuttgart, Германия).

Макромолекулярный синтез

Синтезы ДНК, РНК, и белка  происходили  после высевания в кислотонерастворимый материал радиоактивного  тимидина, уридина,  а также L-лейцина, соответственно. Клетки выращивались на дне  5-мл стеклянных  флаконов  с закручивающейся крышкой; каждый  флакон соответствовал одной  временной  точке, 16  часов  до добавления  радиоактивного материала, приблизительно 1.5 X 105 клеток высевались  в нескольких  флаконах, в которых содержалось  2 мл среды  Игла.  Когда  клеток  насчитывалось приблизительно 2.5X105,  радиоактивные  предшественники  и ингибиторы одновременно  добавлялись  ( в течение 1 минуты)  во все колбы ;  в определенное время , колба, соответствующая данной временной точке опустошалась  от среды, клетки  промывались  2 мл охлажденного  солевого раствора ,  а затем  в колбу добавлялся  1 мл  0.5 мг/мл  раствора додецилсульфата натрия  (Sigma Chemical Co.); клетки  подвергались  лизированию  посредством инкубации при температуре 370 C  на протяжение 10  минут. Полученный  лизат  затем  подвергался гомагенизированию посредством сильного  прокапывания  пять раз при помощи  2 мл  узкой пипетки;  после добавления 1мл  охлажденной 7% перхлорной кислоты, колба  содержалась   при температуре 0°C на протяжении  10 минут;  затем ее содержимое наливали  на бумажный  фильтр  (Schleicher-Schill «Selecta,» No. 602-h) диаметром   2.4 см;  фильтр   пять раз  промывался 5-мл аликвотами  холодной  7%  перхлорной кислоты, затем  в объеме  1:1  промывался смесью спирта с эфиром, затем промывался  эфиром, и наконец,  высушивался, радиоактивность  подсчитывалась на жидкостном сцинтилляционном счётчике Packard, Модель 4322.

После определения  ДНК  синтеза  посредством проведения химического теста, клетки инкубировались  согласно вышеописанному  принципу по определенным  периодам времени, затем они  промывались  холодным раствором хлорида натрия, гомогенизировались  путем добавления  1мл  0.2 N NaOH,  а затем  инкубировались при температуре 370 C  на протяжение 10 минут;  затем  макромолекулы осаждались   посредством  добавления 1  мл холодной 7% перхлорной кислоты, и спустя 10  минут  при температуре 0°C  они подвергались центрифугированию  при 10,000 г   на протяжение 10  минут. Конгломерат  клеток проходил  анализ  на  ДНК по  Бертону (13).

 Результаты

Тесты  на  токсичность

Самая низкая концентрация  педерина, вызывающая  тотальное угнетение роста  клеток культивированных в лабораторных условиях спустя 4 дня  определялась  на нескольких  клеточных линиях. Таблица 1  показывает, что концентрация, составляющая  приблизительно 1.5 нг/ мл  является  достаточной  для блокирования  клеточного  роста.  Более точное исследование  проводилось на EUE клеточной  линии посредством  определения  эффекта  при снижении концентраций  педерина на культивирование (т.е.  на количество  макроскопических  колоний, которые становятся видимыми  спустя  2 недели и разделены высеянными клетками).  Четко выраженная конечная  концентрация  была обнаружена  при 0.3 нг/мл, где не наблюдалось никаких  колоний ,  в то время, как при   концентрации 0.1 нг/мл  эффективность посева  и средний  размер колонии  были такими же, как и в контрольной группе.

Таблица 1

Минимальные ингибиторные  концентрации (МИК)  педерина  на различных штаммах  и клеточных  линиях

Штаммы  или   линии МИК нг/мл
EUE 1.5
E6D 1.5
HeLa 1.5
KB 1.5
Hep 1.5
AS 1.5
MEF 1.5
CE 1.5
BHK 1.0
Z 1 3.1
M 1 3.9

 

Описание  линий и штаммов, а также процедур  смотрите  в  «Материалы и  Методы»

Цитологические  наблюдения

 Блокирование  пролиферирующей способности клеток  ассоциировалось  с заметными цитологическими изменениями.  Для того, чтобы проследить  цитопатогенный  эффект, мы обработали  клеточные  культуры педерином  100 нг/мл  на период времени 0-20  часов. Спустя 50 минут  был отмечен первый  видимый эффект, который заключался  в заметном снижении частоты митоза; более  длительная  обработка  привела  к появлению ярко выраженных признаков  клеточной дегенерации, а именно метафазному  блокированию митоза с хромосомами  аномального  вида.  Последние, зачастую объединялись  в маленькие группы.  У остальных клеток цитоплазма   становилась  более лучепреломляющей  и демонстрировала  большое количество вакуолей . После 5-20  часов  обработки наблюдались  ядерные  фрагментации , после  чего последовал тотальный  клеточный распад.

Окрашенные  препараты  выявили  базофильные участки ,возможно это  является  следствием  выхода  ядерного  материала  в цитоплазму. Этот феномен четко виден  на

Макромолекулярный  синтез

Глубокие изменения, которые наблюдались  на  морфологическом уровне  предполагают  нарушение процессов или структур, которые очень важны  для клетки; считалось, что первичная  локализация действия препарата может  быть определена путем исследования  его  влияния на  основные клеточные функции, такие как синтез макромолекул, при условии  добавления  препарата на ранних этапах, и до проявления каких-либо  морфологических изменений, один из основных  синтезов  оказывался   под  воздействием, поэтому можно было  предварительно  считать, что это и была первичная  цель  педерина.

 Белок и  ДНК синтез

 Синтез ДНК  исследовался  путем   измерения внедрения  радиоактивного тимидина в кислотонерастворимый  материал. Как  показано  на  Рис 3, в течение  10 минут  после  добавления  100 нг/мл  педерина ,скорость  репликации ДНК  снизилась до менее чем 1\10  по сравнению с  репликацией  ДНК в необработанной  контрольной группе ; при проведении такого же эксперимента  белковый  синтез так же измерялся  посредством внедрения радиоактивных предшественников, при этом  блокирование происходило  даже быстрее (см Рис. 3 b) и вероятно   более полноценно, о чем  свидетельствует  немного отрицательный наклон  кривой  внедрения после добавления  препарата.

Рисунок  2 Прогрессирование  цитотоксического  эффекта  при  использовании 100 нг/мл  педерина. Перед  введением  всех препаратов  проводилась гипотоническая обработка, а для ядер  использовался  специальный  метод окрашивания. В таких  условиях цитоплазма обычно не видна, a. Ядра  от обычных клеток, выращенных в отсутствие  педерина. b. Обычная  метафаза в контрольной  культуре. Без  добавления  колхицина, c.  Метафаза  после 90 минутного воздействия  педерина. Хромосомы   сильно  уплотнены,  их  хроматические  компоненты  имеют  тенденцию  к распаду , d. Клетка  после 3 –х часового  воздействия  педерина. Некоторая  часть сильно окрашенного материала  видна в цитоплазме, e. Клетка после  5-ти часового воздействия  педерина. Ядро демонстрирует  признаки дегенерации, т.е. имеет  неровные края и большую  массу пикнотичного материала. f. Клетка  после 22–х часового  воздействия педерина. Ядро фрагментируется  и клетка  подвергается полному  лизису.

Обозначения  на  рисунке  

Leucine – 14 incorporated  mm moles  — Лейцин -14 С включенный   мм  молей

Addition  of pederine  — Добавление  педерина

Control – Контрольная группа

Pederine  100 ng/ ml – Педерин  100 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

Рисунок 3 Эффект  воздействия  педерина  на ДНК и белковый  синтез клеток культивированных в искусственных  условиях. В каждом  флаконе  содержалось  20 мкг тимидина —3Н и 2 мкг лейцина -14C. При назначении, педерин  добавлялся до конечной  концентрации, составляющей  100 нг/мл, 25 минут  спустя  после добавления  радиоактивного материала; подробности  процедуры смотрите в разделе Материалы и методы, a, ДНК синтез; b, белковый синтез.

Отсутствия  эффекта  на РНК синтезе:

В сущности,  одновременное блокирование  двух синтезов  может  быть следствием более общего  клеточного повреждения, которое оказывает влияние  на все клеточные процессы. Эксперимент, продемонстрированный  на Рисунке 4, показывает, что дело обстоит  не так: 100 нг/мл  педерина  не оказывает должного эффекта  на  РНК синтез; более низкая  величина, которая  наблюдается после  180 минут  не может считаться  значительной  с точки  зрения определенного  разброса точек в этом эксперименте.

 

Обозначения  на  рисунке 

Uridine-3Н    incorporated  mm moles  — Уридин  3Н включенный мм  молей

Addition  of pederine  — Добавление  педерина

₀  Control/ Контрольная

∆  Pederine  100 ng/ ml – Педерин  100 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

 Рисунок 4 Эффект  воздействия  педерина на РНК синтез. В каждом  флаконе  содержалось  10 мс тимидина —3Н ;  остальные  данные, как  на Рисунке 3.

Эффект  более  низких  концентраций:

Для того, чтобы  определить, какой  из двух синтезов  блокировался  первым, мы постепенно   понижали  концентрацию ингибитора так, чтобы можно  было  обнаружить  условия, при которых один  из двух процессов оказался бы  под воздействием первым. Рисунок 5  показывает , что даже  при концентрациях ниже 1.5 нг/мл, ярко выраженной  разницы не наблюдается ни в тайминге, ни в степени снижения  скорости синтеза  для двух макромолекул .

Восстановление после удаления препарата :

Такой же  вопрос  возник  при определении  времени восстановления  рассматриваемых  процессов после 40- минутной  обработки 10 нг/  мл  педерина  и при  его последующем  удалении. Как  показано, рисунке 6, складывается  впечатление, что восстановление  белкового синтеза начинается  в пределах  2 и 4 часов после  устранения препарата, в то время, как ДНК   синтез  возобновляется  снова только  после  4 и 8 часов. Такие  данные могут означать, что белковый  синтез  является первым процессом, который  оказывается  под воздействием препарата; таким образом,  восстановление  белкового процесса  будет играть  существенную роль  для восстановления  других процессов, включая ДНК синтез. По сути, в бактериальных  системах, удаление хлорамфеникола, дает такой же результат (14), однако  полученные  нами данные  не являются такими уж четкими, как мы надеялись,  при этом, данная  интерпретация не защищена  от критики.

Действие  пуромицина  и митомицина:

Ответ на   этот  вопрос можно получить  при сравнении  эффекта воздействия педерина  с другими препаратами, механизм действия которых является хорошо обоснованным.  Препаратом избранным для сравнения  стал пуромицин; его структура и подробный  механизм  действия  были описаны Натансом (Nathans (15)),  который    продемонстрировал , что  данная субстанция   имитирует  терминальное связывание  аминоацил-сРНК участка, а следовательно  вводится   термическим способом  в растущую полипептидную цепь и предотвращает  дальнейший  синтез. Рисунок 7  демонстрирует  эффект   воздействия 25  мкг/ мл  пуромицина  на   белковый  синтез  и синтез  ДНК  в  нашем клеточном штамме: кроме того,  блокирование  белкового синтеза  происходит в сущности  одновременно  с  сильным  усложнением  введения  тимидина. Фактически, кривые, изображенные  на рисунке 7 не отличаются  от кривых, изображенных  на рисунке  3.

Рисунок  5  Эффект  воздействия снижения концентрации  педерина  на  синтез ДНК и  белковый синтез.  В каждом  флаконе содержалось 20  мкг тимидина- 3Н  и  2  мкг лейцина-14C,  через 25 минут  после добавления веществ-предшественников, в соответствующие сосуды  был добавлен  педерин  в конечной   концентрации 10 нг/мл (a и c) или  1.5 нг/мл (b and d);   подробности проведения  процедуры, смотрите  в разделе «Материалы   и  Методы», a  и b: ДНК  синтез; c и d:  белковый  синтез.

Обозначения  на  рисунке

а) Thymidine 3Н incorporated  mm moles  — Тимидин 3Н включенный мм молей

Control – Контрольная группа

Addition  of pederine  — Добавление  педерина

Pederine  10 ng/ ml – Педерин  10 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

b) Control – Контрольная группа

Addition  of pederine  — Добавление  педерина

Pederine  15 ng/ ml – Педерин  15 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

c) Leucine – 14 C incorporated mm moles  — Лейцин -14 С включенный мм  молей

Addition  of pederine  — Добавление  педерина

Control – Контрольная группа

Pederine  10 ng/ ml – Педерин  10 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

d) Control – Контрольная группа

Pederine  1.5 ng/ ml – Педерин  1.5 нг/ml

Time in  minutes – Время  в минутах

Мгновенное  блокирование  белкового синтеза и синтеза ДНК на первый взгляд кажется  слишком непонятным. Фактически данные, полученные  из бактериальных систем приводят к предположению  о том, что, если ДНК синтез  оказывается  под воздействием первым, тогда  эффект, оказываемый  на белковый  синтез должен проявляться  намного позже,  при этом вероятно, что он предваряется  угнетением РНК  синтеза;  на самом деле  можно было бы ожидать, что белковый синтез  должен  продолжаться  до тех пор,  пока вся информационная  РНК будет   использована, а транскрипция  генома  будет искажена. С другой стороны  блокирование белкового синтеза  оказывает влияние  на ДНК синтез  только после того, как  хромосома завершает  свою  репликацию.

Рисунок 6 Восстановление  синтеза ДНК  и белкового синтеза после удаления  педерина. В каждый  флакон  в нулевой  момент времени  добавлялось 5 мкг  тимидина 3Н и 0.25  мкг лейцина-14C; одновременно,  педерин добавлялся  в указанные  флаконы  в конечной  концентрации 10 нг/мл; спустя  40  минут,  среду выливали  из части  флаконов, содержащих педерин, а клетки дважды  промывались  2 мл  аликвотами среды; затем добавляли  2 мл среды, содержащей  радиоактивный  материал с продолжением  икубирования, a, ДНК синтез; b, белковый  синтез.

Обозначения  на  рисунке 

а) Thymidine 3Н incorporated  mm moles  — Тимидин 3Н включенный мм молей

Control – Контрольная группа

Removal  of pederine  — Удаление  педерина

Pederine  removed – Педерин  удален

Pederine  10 ng/ ml – Педерин  10 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

b) Leucine – 14 C incorporated mm moles  — Лейцин -14 С включенный мм  молей

Control – Контрольная группа

Removal  of pederine  — Удаление  педерина

Pederine  removed – Педерин  удален

Pederine  10 ng/ ml – Педерин  10 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

Рисунок 7 Эффект  воздействия  пуромицина  на ДНК  синтез и  белковый синтез. В каждом флаконе содержалось  20 мкг   тимидина -3H и 2  мкг лейцина-14C; в указанные  флаконы, пуромицин  добавлялся  в конечной  концентрации  25 мкг/мл, спустя   25 минут после радиоактивного материала, a, ДНК синтез; b, белковый синтез.

Обозначения  на  рисунке 

а) Thymidine 3Н incorporated  mm moles  — Тимидин 3Н включенный мм молей

Control – Контрольная группа

Addition  of puromycin   — Добавление пуромицина  

Puromycin  25 µc/ ml –   25 Пуромицин мкг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

b) Leucine – 14 C incorporated mm moles  — Лейцин -14 С включенный мм  молей

Control – Контрольная группа

Addition  of puromycin   — Добавление пуромицина  

Puromycin  25 µc/ ml –   25 Пуромицин мкг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

Рисунок  8 Эффект  воздействия  митомицина   на синтез  ДНК  и белковый  синтез.  В каждом флаконе  содержалось 5 мкг  тимидина 3Н  и 0.25 мкг лейцина -14C; в нулевой  момент  времени, митомицин  добавлялся  в определенные флаконы  в конечной  концентрации 6 мкг/мл. a, ДНК синтез; b,  белковый  синтез.

Обозначения  на  рисунке 

а) Thymidine 3Н incorporated  mm moles  — Тимидин 3Н включенный  мм молей

Control – Контрольная группа

Mitomycin 6 µc/ ml –Митомицин  6 мкг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

b) Leucine – 14 C incorporated mm moles  — Лейцин -14 С введенный мм  молей

₀  Control/ Контрольная

∆  Mitomycin 6 µc/ ml –Митомицин  6 мкг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

 

Рисунок  9 Эффект воздействия педерина на синтез ДНК по  определению  химических тестов. В определенных флаконах  содержалось 10 нг/мл педерина. Описание процедуры, смотрите  в разделе «Материалы и Методы». Каждый пункт  представляет собой  среднее из пяти определений  на параллельных образцах.

 Обозначения  на  рисунке 

DNA synthesized mµ moles —  ДНК  синтезированный мкмоль

Control – Контрольная группа

Pederine  10 ng/ ml – Педерин  10 нг/мл

Time in  minutes – Время  в минутах

Нужно  отметить, что, как и предполагалось, блокирование ДНК синтеза другим агентом, чей  механизм  действия  хорошо известен, не влечет за собой какого-либо преждевременного  нарушения  белкового синтеза  в нашей системе;  механизм  действия  митомицина был изучен Жибальским  ( Szybalski (17)), который  продемонстрировал  наличие структуры  сшивки  между двумя спиралями  ДНК, что вызывает  мгновенное и специфическое  блокирование  ДНК синтеза. В наших клетках, как показано на рисунке 8, митомицин  оказывает влияние  на репликацию ДНК, оставляя белковый  синтез неизменным. Это свидетельствует о том, что очевидное сопряжение  белкового синтеза и  синтеза  ДНК не происходит  в двух направлениях; скорее  всего складывается впечатление, что продолжительный  белковый синтез  необходим  для  осуществления ДНК репликации.

Таблица II

Влияние  педерина на бесклеточный  белковый синтез

Добавки Фенилаланин  -14 С  включенный
 

 

 

Отсутствие

 

 

Макро  моли

 

10.3

Педерин  10 микрограм/мл 1.2
Педерин  1 микрограм/мл 5.7
Педерин  0.1 микрограм/мл 7.9
Пуромицин   400микрограм/мл 3.4

Исследование  проводилось  в конечном  объеме,  составляющем 0.25  мл.  В каждом  флаконе   содержалось 0.075 микромолей фенилаланина -14 С,  рибосомы  соответственно  до 45 микрограмм  белка, 0.32 мг отстоявшегося  белка ,  а также 40 микрограм полиуридилята  (polyuridylate). Подготовка   системы  накопления  аминокислоты  из EUE клеток.

Таблица III

Эффект  воздействия   педерина  на бесклеточный  ДНК  синтез

Добавки  или  отсутствие dAMP  3Н включенный
 

 

 

Полная система

 

 

Макро  моли

 

86

Без клеточного  экстракта < 2
 Без денатурированной  ДНК 5
Без dGTP, dCTP, dTTP 6
Добавка   педерина  6 микрограм/мл 86
Добавка   педерина  10  микрограм/мл 84

Полная  система   содержала  в полном объеме 0.25 мл, 25 микромолей  dATP-3H (Schwarz Bioresearch, Orangeburg, N.J.), 25 микромолей каждый: dGTP, dCTP, dTTP (Sigma Chemical Co., St. Louis), 2 микромоля  хлорида  магния  (MgCl2), 2 микромоля 2-Меркаптоэтанола, 25 микромолей буферного раствора  Трис — HCl, pH 7.5, 10 мг денатурированного ДНК , и  200 нг суммарного  экстракта  из EUE клеток; приготовление  экстракта  и процедура  проведения  исследования  были описанный  Голдом  и Хелинером (Gold, Helleiner) (24). Контрольный флакон  с содержанием  полной  системой использовался  в линейной  части исследования.

Химическое  определение  ДНК синтеза :

Очень важным   для нас было убедиться  в том, что наблюдаемый   феномен  не являлся  артефактом вследствие  использования  определенной  техники для определения  ДНК синтеза,  а именно  включения меченного  тимидина. Фактически ,  можно предположить, что изменение  белкового синтеза  может препятствовать уровню  тимидин киназы и, как следствие   может привести к недостаточности  включения этого нуклеозида, в то время, как ДНК синтез протекает нормально по пути  тимидилатсинтетазы. Такая  возможность  была проверена  путем проведения   химического исследования ДНК репликации в присутствие  педерина: как  показано  на рисунке 9, препарат  вызывает  реальное и мгновенное  блокирование  образования  клетками  нового  ДНК.

Действие  педерина  на безклеточные экстракты :

Самое  прямое  доказательство  местного действия педерина  было получено  при проведении исследования  его эффекта  на  безклеточные системы  для белкового синтеза или ДНК синтеза; система  включения  аминокислоты из EUE клеток  была  разработана  Перани  ( Perani et al2.) Как показано в Таблице II, синтез фенилаланина  стимулированный  в этой системе полиуридилатом был подвергнут ингибированию  концентрациями педерина  в  100 раз ниже  концентраций  пуромицина,  обеспечивающих  сравнительный  эффект.

С другой  стороны  (Таблица III),  активность ДНК-полимеразы  DNA  в суммарных  экстрактах тех же клеток  остается неподверженной  воздействию 10 мкг/мл  педерина.

Обсуждение

Самой отличительной  особенностью  педерина несомненно является  его потенциал:  концентрации  порядка 1.5 нг/мл, в соответствие  с  3 X 10-9 м, являются  достаточными , чтобы  вызвать клеточную смерть  в течение 4 дней во всех  анализируемых  клеточных линиях, а также  мгновенное  нарушение  белкового и ДНК синтезов; такое количество  препарата соответствует  максимальному количеству молекул, которое приблизительно составляет  107  молекул  в клетке, если допустить, что культуры концентрируются сразу во всем препарате, присутствующем  в клетках. Тем не менее, педерин  в 1,000 — 10,000 раз  активнее  по сравнению  с самыми  распространенными антиметаболитами. Цитологические  наблюдения за  эффектом педерина оказывают небольшую  помощь  в исследовании  специфичности  действия  компонент: фактически, все наблюдаемые клеточные изменения предположительно  обладают генерализированным цитопатогенным  эффектом. Складывается  впечатление,  что анализ макромолекулярного  синтеза дает гораздо больше   информации.

Блокирование  белкового синтеза,  кажется,  происходит мгновенно, то есть, в течение 10 минут  после добавления  препарата, а, следовательно, это происходит гораздо  раньше  в сравнении  с какими-либо  значительными  морфологическими  изменениями;  блокирование  ДНК  репликации  происходит почти одновременно  с блокированием  белкового синтеза, однако вероятно  в меньшей  степени. Это незначительная  разница  (Рисунок. 2),  и скорейшее  восстановление  аминокислотного включения  после удаления препарата  (Рисунок. 5),  указывают на то, что  белковый синтез  оказывается  под воздействием  препарата, первым; tТакое заключение  подкрепляется очевидной  идентичностью  эффектов   воздействия педерина  и пуромицина  (Рисунок. 6),  а также   противоположным поведением  митомицина. Еще более  прямое подтверждение дают данные, полученные   от использования  безклеточных экстрактов: педерин заметно ингибирует безклеточный  синтез белков, в значительной  мере больше, чем пуромицин, и в тоже время  он не существенно  влияет на ферментативный   синтез ДНК .

Очевидную  сильную  взаимосвязь  белкового  синтеза и синтеза ДНК,  в то время, как синтез  РНК  остается  неподверженным  воздействию  препарата, еще предстоит  объяснить. Фактически, такой феномен  уже был описан  у высших организмов  (18, 19),  при этом, недавно  полученные данные  очень схожи   с нашими, полученные Янгом (Young) (20), который  использовал  пуромицин  и многие другие агенты  специально  для блокирования  белкового синтеза: все эти вещества при проведении  исследований на клетках, культивированных  в лабораторных условиях значительно снижают  в течение  нескольких минут  скорость  ДНК  репликации, при этом, не оказывая  влияния  на РНК синтез.

Как уже говорилось выше, эти данные  не согласуются  с тем, что происходит  в бактериальных системах, где  только инициация  хромосомной репликации  находится в зависимости  от белкового синтеза, а  ДНК репликация  прекращается,  в среднем  приблизительно в одно время  генерации после блокирования  белкового синтеза. В нашей системе ,  между тем , время генерации составляет  приблизительно 24 часа,  а завершение  хромосомной репликации  занимает по крайней  мере 6  часов, ДНК  синтез прекращается  в течение нескольких минут после прекращения  белкового синтеза.

Другие авторы  уже обсуждали  возможные причины  тесной  взаимосвязи (18-20). Мы должны коротко упомянуть самые очевидные гипотезы:

  1. Вероятная необходимость в продолжительном  синтезе гистонов  или воспроизведении  гипотетической фракции липопротеина;
  2. Синтез белковых линкеров ;
  3. Подразделение эукариотной хромосомы  на  большое  количество функциональных  элементов  ( возможно соответствующих  «репликонам», описанных  Якобом  (Jacob et al)., 21),  каждый из которых   требует синтеза своего белка «инициатора» для начала  репликации;  в данном случае, если количество элементов было  достаточно большим, то отставание во времени  между блокированием  белкового синтеза  и блокированием ДНК репликации  может быть  в пределах  нескольких минут, в соответствие  с  наблюдениями во время  экспериментов, описанных здесь .

Последние  данные, полученные  Карнис (Cairns) (22) и Плот( Plaut et al.) (23)  согласуются  с постулатами  гипотезы № 3,  демонстрируя  по крайней мере  репликацию  100 элементов  хромосомы  человека  в нашем случае  и 50  в хромосоме  дрозофилы .  Такое высокое количество  функциональных элементов может   объяснить  полученные  нами  результаты .

Данные, представленные  здесь, продемонстрировали , что педерин  блокирует  белковый синтез в клетках млекопитающих. Значительный потенциал препарата  стимулирует интерес  к получению  детальной информации о его  механизме  действия. Этот препарат может стать избранным агентом  для изучения с целью  определить причины острой потребности  в продолжительном  белковом синтезе для  обеспечения нормальной скорости  репликации   эукариотных  хромосом. Понимание  этого феномена возможно поможет прояснить  структурную и функциональную  организацию  хромосом высших организмов.

Данная  работа  получила поддержку  грантом  от  «Euratom-CNR-CNEN», Контракт No. 012-61-12 BIAI. Один из нас получил  поддержку  (M. P.) грантом  от «CNR», Рим.

 

Публикация  14  августа 1967 года,  публикация  с поправками 6 ноября 1967 года.

Использованная  литература

  1. Pavan, M., and G. Bo. 1953. Comp. Oecol. 3:307.
  1. Cardani, C., D. Ghiringhelli, R. Mondelli,
  2. Pavan, and A. Quilico. 1965. Ann. Soc. Entomol. Franqaise. 1:813.
  3. Pavan, M. 1963. Ricerche biologiche e mediche

su pederina. M. Ponzio Corp., Pa via.

  1. Soldati, M., A. Fioretti, and M. Ghione. 1966.

Experientia. 22:176.

  1. Terni, M., and G. B. Lo Monaco. 1958.

Sperimentale. 108:177.

  1. De Carli, L., J. J. Maio, F. Nuzzo, and A. S.

Benerecetti. 1964. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 29:223.

  1. Gey, G. D., W. D. Coffman, and M. T.

Kubicek. 1952. Cancer Res. 12:264.

  1. Fjelde, A. 1955. 8:845.
  2. Nuzzo, F., L. De Carli, G. Rita, M.

10. Russi, and L. Fischer-Fantuzzi. 1963. Atti Assoc. Genet, ltd. 8:111. 10. Eagle, H. 1955. Proc. Soc. Exptl. Biol. 89:362.

  1. Stoker, N., and I. MacPherson. 1964.

203:1355.

  1. Eagle, H. 1955. 122:501.
  2. Burton, K. 1956. J. 62:315.
  3. Aronson, A. I., and S. Spiegelman. 1961. Bio-

chim. Biophys. Acta. 53:84.

  1. Nathans, D. 1964. Federation Proc. 1:984.
  2. Maal0e, O., and P. Hanawalt. 1961. Mol.

Biol. 3:144.

  1. Szybalski, W., and V. N. Iyer. 1964. Federation

Proc. 1:946.

  1. Littlefield, J. W., and P. S. Jacobs. 1965. Bio-

chim. Biophys. Acta. 108:652.

  1. Taylor, E. W. 1965. Cell Res. 40:316.
  2. Young, C. W. 1966. Pharmacol. 2:50.
  3. Jacob, F., S. Brenner, and F. Cuzin. 1963. Cold

Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:329.

  1. Cairns, J. 1966. Mol. Biol. 15:372.
  2. Plaut, W., D. Nash, and T. Farming. 1966.

Mol. Biol. 16:85.

  1. Gold, M., and C. W. Helleiner. 1964.

Biophys. Acta. 80:193.

Перевод с английского.


Создание сайта: студия Сергея Каминского © 2012 —2021 amaliy.com все права защищены